便携式CD光谱仪--测量柠檬酸
在最近的研究中，柠檬酸（2;2-羟基-1，2，3-丙三羧酸，CA）被认为是尿石症的生物标志物，因为低枸橼尿酸尿（CA 320mg/24 h，而正常值为650mg/24 h）是尿路结石形成的重要危险因素。
便携式CD光谱仪对基于十二烷基硫酸钠-AgNPs的柠檬酸作为尿石症生物标志物的比色检测（内部资料，以供学习）
尿石症是泌尿系统中最常见的疾病之一，在全球范围内发病率非常高，例如，北美为7%-13%，欧洲为5%-9%，亚洲为1%-5%[1]。更糟糕的是，由于我们生活方式和饮食的改变，其发病率和相关的医疗费用都在上升[2]。目前，尿石症的主要检测的新方法是B型超声扫描和常规尿高镜检查。
在最近的研究中，柠檬酸（2;2-羟基-1，2，3-丙三羧酸，CA）被认为是尿石症的生物标志物，因为低枸橼尿酸尿（CA 320mg/24 h，而正常值为650mg/24 h）是尿路结石形成的重要危险因素[3]。同时，CA也被认为是控制尿路结石形成的重要因素。
CA可与钙离子复合，以防止与其他离子（如草酸盐和磷酸盐）结合，从而抑制尿路结石的形成。因此，检测尿液中的CA对于尿石症的早期筛查和预后监测具备极其重大意义。已经报道了用于检测CA的各种分析方法，包括高效液相色谱（HPLC），化学发光，气相色谱，分光光度法，电化学，荧光.但是，其中许多方法非常耗时，并且需要昂贵的设备。
其中，比色法具有检测结果可视化、所需设备简单、操作便捷、检测快速等诸多突出优点，是CA检测的有前途的方法。
银纳米颗粒（AgNPs）是过去二十年中研究最多的金属纳米材料之一。由于表面效应、量子尺寸效应、表面增强拉曼光谱和抗菌功能等特性，AgNPs大范围的应用于水净化]、抗菌活性、催化、拉曼散射和其他。此外，AgNPs的消光系数比相同尺寸的金纳米颗粒的消光系数大100倍，在比色法检测中可表现出更显着的吸光度变化和更好的灵敏度。
AgNPs 溶液的颜色随 AgNP 的聚合状态而变化。具体而言，当分散的AgNPs聚集到不同程度时，颜色会从亮黄色变为橙色，棕色甚至灰色。因此，基于AgNPs的比色传感非常关注，包括重金属，生物小分子等的检测。据我们所知，很少有关于CA比色检测的研究报道。本文提出了一种基于十二烷基硫酸钠（SDS）修饰银纳米颗粒（AgNPs）测定柠檬酸的简单、低成本、灵敏的比色法。
由于AgNPs具有易于合成、成本低、表面改性的特点，因此被用作比色传感器探针，其中SDS既是改性剂又是稳定剂。如图1A所示，SDS可以有选择地与Al协调3+，导致 SDS-AgNPs 的聚合。因此，溶液颜色从亮黄色变为橙色再到棕色。当 CA 存在时，Al3+将与CA而不是SDS-AgNPs复杂化。
因此，SDS-AgNPs能保持分散状态，溶液保持亮黄色。通过检验测试溶液的吸光度，可以定量测定样品中CA的浓度。此外，使用图1B所示的自主研发的便携式CD分光光度计（CD），比酶标仪小得多，重量轻得多，CA可以简单，快速和便携的方式来进行检测。
图 1.基于SDS-AgNPs聚集的CA比色检测原理;B：CD的结构和检测过程。
CD的大小为20.0厘米×12厘米×10厘米（如图所示。S1a），比酶标仪小得多（39cm×45cm ×63cm）。此外，CD的重量为0.5 kg（不含手机），与酶标仪（45 kg，无检测盒）的重量相比要轻得多。CD的结构如图1所示。S1b，由一部移动电话、一个可调照明提供商和一个CD（光盘）段组成。光穿过含有样品溶液的石英比色皿，然后穿过狭缝，在CD段上结束，CD段将光分成多色带。通过极值法可以建立像素位置与透射光波长之间的对应关系。然后，可以将手机拍摄的光谱照片中的像素位置转换为波长。在这项工作中，手机相机参数为ISO为400，曝光时间为0.5s，日光模式的白平衡。
根据以前的文献[28，29]，SDS-AgNPs是通过减少AgNO来制备的。3与NaBH4，SDS同时被用作AgNPs的稳定剂和修饰剂。2.8 毫升新鲜制备的 0.1 M NaBH4迅速加入到 100 mL 的 0.4 mM AgNO 中3水溶液在室温下在黑暗中搅拌，生成明亮的黄色溶液。搅拌20 min后，加入1.6 mL 0.05 M SDS溶液，在黑暗中2h后停止搅拌，以确保SDS改性到AgNPs表面。合成的SDS-AgNPs在4°C的黑暗中储存，并能稳定数周。
用0.02 M三乙酸缓冲液调节SDS-AgNPs溶液至pH = 7。将3 mg/L硝酸铝溶液与CA溶液或测试溶液等体积混合。振荡15分钟后，将800μLSS-AgNPs溶液，160μL硝酸铝和CA混合溶液加入石英比色皿中。孵育5分钟后进行仔细的检测。利用550 nm和600 nm波长处的强度来分析样品溶液的颜色变化。
正如研究报告，通过用硼氢化钠化学还原合成的SDS-AgNPs在几个月内稳定。SDS的存在在AgNPs表面引入了大量的负电荷，保护纳米颗粒在水溶液中分散。Zeta电位与纳米颗粒的稳定性有显著相关性[31]。zeta电位的负值表明纳米颗粒表面的封端化合物有着非常强的负电荷，这导致颗粒之间的排斥，从而避免了纳米颗粒的聚集，实现了AgNPs的更高稳定性[32]。无花果。S2a和图。S2b证明了AgNPs和SDS-AgNPs的Zeta电位，分别为−11.31 mV和−43.1 mV，因此SDS-AgNP在水溶液中具有更高的物理稳定性。为了进一步验证SDS对AgNPs的稳定作用，在1 h内制备的AgNPs和SDS-AgNPs的A390/A510在5 min内记录。结果如图1所示。S2c.如图所示。S2c显示，裸AgNPs的A390/A510在5 min内从8.3降低到3.4，表明AgNPs不稳定，很快聚集，溶液的颜色在60 min内从亮黄色变为棕色。相反，SDS-AgNPs的A390 / A510在60分钟内保持在10左右，溶液颜色保持为亮黄色。
SDS-AgNPs的FT-IR光谱如图所示。S2d，表明根据研究，SDS已经修改到AgNPs上[29，33]。峰值 3357 厘米−1对应于SDS的C-H拉伸振动，其范围为2800-3800厘米−1.CH的抗对称和对称拉伸振动2的 SDS 记录在 2918 厘米处−1和 2850 厘米−1.1471厘米处的峰值−1对应于 C–H 的弯曲振动。SDS硫酸盐组在1234 cm处表现出抗对称和对称的拉伸振动。−1和 1001 厘米−1分别。和峰值在827厘米−1在光谱中观察到对应于S-O-C组的弯曲振动。
为了确认SDS-AgNPs溶液的颜色与其聚集状态之间的关系，不同浓度的Al3+已添加到 SDS-AgNPs 解决方案中。然后捕获不一样的颜色溶液的图像，同时通过TEM观察SDS-AgNPs的形态。结果如图2所示。SDS-AgNPs呈球形，粒径约为5nm。当没有铝3+存在，溶液颜色为亮黄色，并且SDS-AgNPs分散良好（图2A）。添加 Al3+，SDS-AgNPs 将聚合。更多 Al3+将导致更显着的聚集，并且溶液颜色从黄色变为橙色甚至棕色，如图2B-F所示。根据结果得出，SDS-AgNPs溶液的颜色与SDS-AgNPs的聚集状态有关。
在这项工作中，SDS-AgNPs的pH值，Al的浓度3+并优化了孵育时间。采用0.02 M三醋酸缓冲液调节SDS-AgNPs溶液至不同pH值（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）。未发现明显的颜色变化（图.S3a），SDS-AgNPs的吸光度谱基本一致（图.S3b）在不同的pH值下，表明SDS-AgNPs在pH值为6-8时稳定。用不同浓度的Al研究pH值的作用3+（0， 0.5， 1， 1.5， 2， 2.5， 3， 3.5 mg/L） 在不同 pH 值下（图 3A–B）。不难发现，溶液颜色只是改变了，而A390/A510（390 nm和510 nm波长处的吸收比）在pH值为7.5和8的pH值下在10左右稳定。同时，在pH值为6.0和6.5时，溶液颜色变为灰色，A390/A510当加入0.5毫克/升和1毫克/升Al时降至约43+分别。在pH值为7时，溶液颜色随着Al的增加而变化3+和 A390/A510与Al浓度呈线 mg/ L的范围内，这为随后的CA检测提供了更宽的检验测试范围。最佳 pH 值为 7 也与 pKa 一致3的 CA，即 6.40 [34，35]。当pH值高于6.40时，CA主要以C的形式存在于溶液中6H5O73−，这更加有助于与Al复合3+[[36]。因此，能大大的提升用于CA检测的比色法的灵敏度。
Al的最佳浓度3+还通过检验测试不同浓度（0，0.5，1，1.5，2，2，5，3，3.5，4.0，4.5mg / L）的AgNPs的吸收来研究Al。3+溶液。结果如图3C–D所示。在0-3毫克/升的范围内，A390/A510的溶液由于SDS-AgNPs的聚集而减少。当Al浓度3+高于 3 毫克/升，A390/A510保持不变，这表明SDS-AgNPs已经完全聚合。因此，选择3 mg /L作为Al的最佳浓度3+，这也与之前的pH优化实验结果一致。
孵育时间会明显影响比色法的传感性能。至于SDS-AgNPs聚集反应的孵育时间，用20μL 3mg / L Al混合溶液3+并将20μL 5mg / L CA摇动30分钟（用于充分反应）。然后将200μL SDS-AgNPs加入溶液中，A的变化390/A510每分钟记录一次混合溶液。结果如图3E所示。
反应10分钟后，A的值390/A510缓慢下降，溶液的颜色不再改变。因此，选择10分钟作为添加SDS-AgNPs后的孵育时间。Al之间反应的最佳孵育时间3+通过将混合溶液与Al孵育来确定CA3+和CA的不同时间从2分钟到20分钟。A的变化390/A510如图3F所示。The A390/A510根据结果得出，14 min 是自 Al 以来的最佳孵育时间3+和CA彼此彻底反应。
如第2.4节所述，使用不相同浓度的CA进行定量分析。10 min后观察混合溶液的吸收光谱和颜色变化。结果如图4所示。随着CA浓度的增加，390 nm处的吸收增加，而510 nm处的吸收减少。因此，建立了ΔA的标准曲线++CA）- A390/A510（铝3++CA）） 作为 y 轴，CA 浓度作为 x 轴。线 mg/L，相关系数为 R2= 0.9825，检测限为0.21毫克/升。
图 4.答：不同CA浓度的SDS-AgNPs的吸收光谱;B：不同CA浓度的SDS-AgNPs的标准曲线. 方法的选择性
为了评估基于SDS-AgNPs的方法的选择性，尿液中典型物质（尿素，尿酸，肌酐，葡萄糖，草酸，Cl）的干扰作用−研究了K，Na和混合溶液）。首先，有必要检测SDS-AgNPs在存在这些物质的情况下是否会聚集。在最佳条件下，Al的浓度++3+为3 mg / L，这些物质的浓度为表S1所示尿液中平均浓度的百分之一。与 Al 的结果不同3+，当上述物质存在时，溶液颜色（图S4），吸收光谱（图5A）和A的值390/A510(图 5B）与对照组相同（SDS-AgNPs溶液）。它指出，SDS-AgNPs在存在这些物质的情况下不会聚集。
同时，这些物质对CA和Al组合的影响3+被探索。同样，Al的浓度3+为3 mg / L，CA浓度为5 mg / L。在Al面前3+，将CA和其他物质添加到SDS-AgNPs溶液中。加入其他物质的溶液的颜色（图S5）和吸收光谱（图5C）与Al-SDS-AgNPs相同，ΔA390/A510（ΔA390/A510= A390/A510（铝3++化合物）- A390/A510（化合物））比使用CA的溶液小得多（图5D）。根据结果得出，添加其他物质对CA检测无影响，验证了CA检测的良好选择性。
使用CD对CA的分析如第2.5节所述进行。结果如图6所示。随着CA浓度的增加，溶液颜色从棕色变为橙色，最后变为黄色。照片中的像素变亮，550 nm和600 nm处的强度也增加。计算后，在3-11 mg/L的范围内，CA浓度与ΔI呈线（ΔI = 强度Al+ CA- 强度铝），线 mg/L的范围内，CA浓度与ΔI呈线.9516，LOD为0.49 mg/L。
表S3中介绍了与其他文献检测CA的比较。从表中能够准确的看出，这种基于SDS-AgNPs的比色法具有便携式方式可接受的检验测试范围和检测限。此外，与其他材料相比，SDS-AgNPs更容易合成，这更加有助于传感器的进一步使用。
本文提出了一种基于SDS-AgNPs测定柠檬酸的简单而灵敏的比色法。不同浓度Al的SDS-AgNPs3+以不同的聚集状态为特征。根据结果得出，SDS-AgNPs溶液的颜色与SDS-AgNPs的聚集程度有关。在pH = 7和浓度为3 mg / L Al3+的条件下，则获得CA检测的最宽的检测范围。
选择10 min和14 min作为加入SDS-AgNPs3+后的最佳孵育时间和Al的孵育时间和 CA 肤色。该方法的选择性也得到了验证，表明尿液中的几种常见物质对CA检测没有干扰作用。该方法具有1-10 mg / L的宽线性范围，使用酶标仪计算出检测限为0.21 mg / L。使用自制的便携式CD光谱仪，线 mg / L，基于不同波长下的强度，LOD为0.49 mg / L。此外，该方法在人造尿液样本中来测试，回收率范围为93%至112%。因此，基于SDS-AgNPs的CD比色法拥有非常良好的CA现场检验测试能力和应用。
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