免疫荧光显微成像详解（上）——免疫荧光原理、步骤
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，它是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
直接法将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
间接法如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。
免疫荧光实验的主要步骤包括 样片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育、封片及荧光检测等。
对于单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过（70%乙醇中浸泡）的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片即可，操作的流程要小心，防止细胞脱片。
对于悬浮生长细胞，有两种方式，一种是取对数生长细胞，制备细胞片或直接制备细胞涂片，把细胞片浸入封闭液中固定，封闭后滴加一抗和二抗孵育；另一种是先在悬浮液中做固定和染色，离心洗脱后，用移液管移至盒式玻片进行后续抗体孵育。
对于冰冻切片制备，建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。组织一定要冷冻适度，切片时选用干净锋利的刀片，防止裂片和脱片。
固定时间则取决于固定组织切片的大小和类型，对大多数组织，18-24h即可，而细胞的固定时间较短。
针对胞内抗原，使用0.5% Triton X-100或丙酮等通透剂进行通透，这一步的目的是使抗体进入胞内。
为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用封闭液（一般来说包括与二抗同一来源的血清、BSA或者羊血清）封闭，减弱背景着色。封闭开始后，要注意样品的保湿，避免样品干燥，否则极易产生较高的背景。
一抗孵育温度大体上分为：4℃、室温、37℃，其中4℃效果更加好；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37℃孵育1-2h，4℃过夜（从冰箱拿出后37℃复温45min）。具体条件还要根据样品、稀释液等条件进行摸索尝试。
荧光二抗孵育一般在室温或37℃孵育30min-1h，该过程必须在避光环境下进行，防止荧光淬灭。荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能会出现大量的游离荧光素残留，必须要格外注意配制时采用小包装并进行适当的离心。
一般采用DAPI进行复染，目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。
为了长期保存，我们应该对样本做封片，用吸水纸吸干爬片上的液体，一般用缓冲甘油等或专门的抗荧光淬灭的封片液。
有条件的话最好立即用荧光显微镜观察拍照，若不能及时拍照，也要做好封片和封固，保持避光和湿度。荧光显微镜的成像能力对最终的结果也会造成非常大的影响，好的荧光显微镜能够最大限度地收集荧光信号，并呈现高分辨率的图片，使细节更清楚，更易得到一张效果极佳的结果图。
切片清洗：为避免一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)特别的重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。
(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求（建议PH在7.4-7.6，浓度是0.01M；中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）。
根据上述步骤完成免疫荧光实验后，就有必要进行荧光显微成像，得到我们想要的结果。选择一款简单易操作、成像清晰、效果卓越的荧光显微镜进行观察拍照，才能轻松得到更为理想的结果图，达到事半功倍的效果。
Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜作为一款电动化、智能化的显微镜，具有以下优势：
极大地降低了背景噪音和荧光干扰，提高图像锐度，加深细节，得到分辨率更高的图片；
通过高精度电动化Z轴层扫来扩大景深，解决厚样本观察问题，提高图像分辨率；