【细胞自噬】基于LC3的细胞自噬检测方法
10/01/2024 彩杏娱乐平台app
在生理条件下，细胞自噬活性通常较低。但在饥饿、缺氧和疾病等刺激下细胞自噬活性会显著上调。另外，细胞自噬抑制也与某些疾病相关，如癌症、神经退行性疾病和传染病等。鉴于细胞自噬与不同的生理和病理生理过程之间有紧密联系，故科学工作者要选择理想的细胞自噬检测的新方法。下面介绍一下基于LC3的细胞自噬检测方法：
利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价细胞自噬形成。细胞自噬形成时，胞浆型LC3-I会酶解掉一小段多肽，随后跟PE结合转变为膜型的LC3-II。因此能通过LC3-II/I比值的大小估计细胞自噬水平的高低。
LC3蛋白被募集到自噬体形成绿色点状结构，因此，能够最终靠荧光显微镜观察内源性LC3或GFP-LC3，即可实现对细胞自噬发生的检测。与不存在溶酶体抑制剂时相比，存在溶酶体抑制剂时LC3点状体数量的增加代表了在处理期间降解的自噬体数量。
a组：自噬激活的细胞，b组：自噬诱导缺陷型细胞，c组：溶酶体降解不足细胞
细胞自噬形成时，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋白转移至细胞自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色或黄色荧光斑点。当细胞自噬溶酶体形成后，酸性的溶酶体环境使GFP荧光淬灭，而mCherry荧光不受影响，细胞自噬溶酶体呈现红色荧光。因此，能够最终靠LC3荧光指示系统来监测细胞自噬流。
流式细胞术是定量测量荧光标记蛋白水平的有效工具。自噬小体内膜上的LC3在溶酶体中被降解，因此，LC3的整体降解量能够最终靠GFP-LC3荧光的降低进行仔细的检测，是检测自噬活性的良好指标。GFP强度因营养饥饿降低，而自噬或溶酶体抑制剂则增强GFP强度。